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本试剂盒采用改进的SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅胶质膜在高盐、低pH条件下高效特异结合裂解液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将蛋白质、基因组DNA、RNA和其他杂质去除，最后使用低盐、高pH的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。本制品不使用毒性较大的苯酚、氯仿等试剂，每个吸附柱可吸附高达20μg的质粒DNA。纯化的质粒DNA可直接用于酶切、PCR、测序、连接、转化、转染等分子生物学实验。

• 首次使用前请短暂离心RNase A，将试剂盒提供的RNase A溶液全部加入Buffer P1中（终浓度100μg/mL），加入后请及时打勾标记，避免多次加入，混匀后置于2～8℃保存。如果溶液P1中RNase A酶活降低，提取的质粒会有微量RNA残留，向溶液P1中补加RNase A即可。
  
• 首次使用前按Buffer WB和Buffer PW瓶身标签所示，加入指定量无水乙醇，加入后请及时打钩标记，避免多次加入，混匀后于室温保存。
  
• 环境温度较低时，Buffer P2、Buffer B可能有沉淀产生，使用前可在37℃下预热至沉淀完全溶解，混匀后再使用，不要剧烈摇晃。
  
• Buffer PW可以去除痕量核酸酶等杂质，如果宿主菌为endA+（TG1、BL21、HB101、ET12567、JM系列等）等核酸酶含量较高的菌株时，必须使用Buffer PW；如果宿主为endA-（XL1 Blue、TOP10、DH5α等）等核酸酶含量低的菌株时，可以省略Buffer PW。
  
• 质粒提取得率和质量与宿主菌种类、质粒拷贝数、质粒大小及质粒稳定性等因素有关。若需要提高质粒提取得率，推荐使用Buffer B先平衡吸附柱。
  
• 如果提取低拷贝质粒或者>10kb的大质粒时，应适当加大菌体使用量，使用6～10mL菌液，同时需加倍Buffer P1、Buffer P2和Buffer P3的用量，其它步骤相同。
  
• Buffer EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用ddH2O洗脱，并确保ddH2O的pH在7.0～8.5范围内，pH低于7.0会降低洗脱效率。
  
• 质粒DNA确切的分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。
  
• 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化、各溶液使用后应及时盖紧盖子。
  
• 注意不要直接接触Buffer B、Buffer P2、Buffer P3和Buffer PW，使用应戴手套。

• 取1.5～5mL过夜培养（12~16h）的菌液，加入离心管中（自备），12000rpm离心1min。弃培养基，倒扣于吸水纸上吸尽残液。
  
• 向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL Buffer P1（请先检查Buffer P1是否已经加入RNase A）重悬菌体沉淀，涡旋振荡至看不到细菌团块。
  
  • 若有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
• 向步骤2中加入250μL Buffer P2，温和的上下颠倒混匀6～8次，使菌体充分裂解。
  
  • 轻轻颠倒混匀，切勿涡旋，否则会引起基因组DNA断裂，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。如果溶液变得粘稠而透亮，表明细菌已充分裂解。若溶液未变清亮，可能由于菌体过多导致裂解不彻底，应适当减少菌体量。操作时间不要超过5min，以免质粒受到破坏。
• 向步骤3中加入350μL Buffer P3，立即温和地上下颠倒8～10次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀。13000rpm离心10min，小心取上清。
  
  • Buffer P3加入后应立即颠倒混匀，以防止SDS产生局部沉淀而影响中和效果。若上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
• （可选）将吸附柱置于收集管中，加入100μL Buffer B至吸附柱膜上。12000rpm离心1min，弃收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。
  
  • 如果吸附柱放置时间过长、暴露于空气时间过久或者回收率偏低时，推荐采用此步。Buffer B处理过的柱子应当天使用，放置时间过长会影响效果。
• 将步骤4上清用移液器小心转移至吸附柱中，注意不要吸到沉淀，12000rpm离心30~60 s。弃废液，把吸附柱重新放回收集管中。
  
• （可选）加入500μL Buffer PW（请检查是否已加入无水乙醇）至吸附柱中。12000rpm离心30~60 s。弃废液，把吸附柱重新放回收集管中。
  
  • 如果宿主菌是endA+基因型（TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。
    
  • 如果宿主菌是endA-基因型（DH5α，TOP10等），此步可省略。
• 加入600μL Buffer WB（请检查是否已加入无水乙醇）至吸附柱中。12000rpm离心30~60 s。弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
  
• 重复步骤8。
  
• 将吸附柱放回收集管后，12000rpm离心2min，尽量去除吸附柱中残留的Buffer WB。
  
  • Buffer WB中的乙醇残留会影响下游的酶反应，如酶切、酶链、PCR等。此步骤不可省略。
• 将吸附柱置于一个新的无菌1.5mL离心管中。在吸附膜的中间部位加入50～100μL Buffer EB。室温静置2min，12000rpm离心1min洗脱DNA。
  
  • 洗脱体积不应少于30μL，低于30μL会导致洗脱效率下降。若需要获得最高产量，将洗脱缓冲液EB预热至65～70℃提高洗脱效率。此外可将离心得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复步骤10进行二次洗脱。若后续做测序需使用ddH2O洗脱，并确保ddH2O的pH在7.0～8.5范围内，pH低于7.0会降低洗脱效率。
• 弃去吸附柱，将质粒DNA保存于-20℃，以防止降解。